三、rna引物
目前所发现的dna聚合酶都需要一个具3′-oh的引物，才能将合成原料dntp一个一个接上去。因为dna聚合酶不能催化两个游离的dntp在dna模板上进行聚合，如图12-3所示。实验又发现抑制rna聚合酶的药物如利福霉素(rifampicin)能抑制dna的复制。再者在体外dna复制实验中发现冈崎片段的5′端都有一小段4~12个核苷酸的rna引物(rna primer)。现知rna聚合酶合成新链时不需要引物，能直接催化游离ntp聚合。可见rna引物为dna聚合酶提供聚合新核苷酸所需的3′-oh。rna引物最后被dna聚合酶ⅰ除去，留下的空隙也由该酶补满，缺口再由dna连接酶封口。在dna的复制需要rna引物呢，除了dna聚合酶不能催化两个游离dntp的聚合，而rna引物酶却具有此能力外，这种作用尚可尽量减少dna复制起始处的突变。因为游离核苷酸起始处的聚合最容易出现差错，若用rna引物，即使出现差错，由于最后将被dna聚合酶ⅰ切除，便可提高dna复制的真实性。四、引发体
引发体(primosome)是由多种蛋白质及酶组成，是dna复制开始所必需的。引发体中的某些蛋白质如dnaa能结合至dna复制起始部位，dnab具有解链酶的作用，dnac辅助dnab结合到复制起始点，使起始部位的双链解开。而引发体中的引物酶(primase)在已解开起始部位的dna单链按碱基互补配对催化ntp聚合，合成一小片段的rna，作为dna合成的引物，即沿此引物rna的3′-oh进行延伸。四、真核生物端粒dna的复制
真核生物线性染色体的两个末端称为端粒(telomere)。按上述dna**制新合成子链5′端的那段rna引物被切除后，必留下一个空缺，假如每次细胞**或dna复制都是如此，端粒将会不断缩短，最终导致关键基因的丧失及种系灭绝的危险，但事实并非如此。那么真核生物一定存在着某种阻止端粒缩短的机制。(一)端粒dna的结构和端粒酶
对端粒dna序列的分析，发现端粒dna的3′端是由数百个串联重复gt丰富的短的寡核苷酸序列，如四膜虫的重复序列为-ggggtt-，人为-agggtt-。端粒dna序列虽不含功能基因，但对维持染色体的稳定性起着重要作用。如果端粒丧失，染色体之间可能出现端-端融合、降解、重排乃至染色体丢失等变化，最后细胞衰亡。近年来，发现了一种能防止端粒缩短的酶，称为端粒酶(telomerase)，该酶由蛋白质和rna两部分组成，其中rna作为合成端粒dna的模板，端粒酶是目前所知唯一携带rna模板的逆转录酶，具有种属特异性，例如四膜虫的端粒酶，其rna部分含159个核苷酸，其中有一段序列为5′-caaccccaa-3′可作为合成端粒dna3′端gt 丰富序列-ggggtt-模板。人端粒酶的rna含450个碱基，其中-cuaacccuaac-为合成-agggtt-的模板。这样可防止细胞**时dna复制端粒的缩短。端粒、端粒酶和细胞的衰老有密切关系。有人将端粒称为分子钟或有丝**钟。但是恶性肿瘤细胞当端粒缩短到某种程度，端粒酶活性又重新出现，对端粒进行补偿，使之永不衰亡，形成恶性增殖。(二)端粒酶的作用机制
第四节dna的损伤与修复
dna是储存遗传信息的物质。从生物遗传角度来讲，要求在复制过程中保持遗传密码的稳定性，物种才能得以延续。哺乳动物单倍体细胞的基因组由2.9x109 bp dna组成。动物一生中，从受精卵细胞到个体死亡，这些遗传密码要经过千万次的复制。在物种进化的长河中，dna复制的次数更是难以计数，而且生物体内外环境都存在着使dna损伤（dna damage）的因素。可见，除dna复制的高度真实性外，还要求某种修复dna损伤的机制。每一遗传信息都以不同拷贝储存在dna两条互补链上。因此，若一条链有损伤，可被修复酶切除，并以未损伤的信息重新合成与原来相同的序列，这就是dna修复（dna repair）的基础。但是在漫长的进化过程中，dna的序列还是会发生改变,通过复制传递给子代成为永久的，这种dna的核苷酸序列永久的改变称为突变(mutation)。若发生的突变有利于生物的生存则保留下来，这就是进化；若不适应于自然选择(nature selection)则被淘汰，因此生物的进化可以看成是一种主动的基因改变过程，这是物种多样性的原动力。所以，生物的变异是绝对的，修复是相对的。一、造成dna损伤的因素
造成dna损伤的因素有生物体内自发的、亦有外界物理和化学等因素。(一)自发的因素
由于dna分子受到周围环境溶剂分子的随机热碰撞(thermal coll**ion)，腺嘌呤或鸟嘌呤与脱氧核糖间的n-糖苷键可以断裂，使a或g脱落。人体细胞中dna每天每个细胞要脱落5 000个嘌呤碱，每天每个细胞也有100个胞嘧
啶自发脱氨而成尿嘧啶。(二)物理因素
1．紫外线损伤由于嘌呤环与嘧啶环都含有共轭双键，能吸收紫外线而引起损伤。嘧啶碱引起的损伤比嘌呤碱大10倍。损伤是由于嘧啶二聚体的产生，即2个相邻嘧啶碱的c5和c6共价交联，如图12-18所示。2．电离辐射损伤如x射线和γ射线，可以是辐射能量直接对dna的影响，或dna周围的溶剂分子吸收了辐射能，再对dna产生损伤作用。如碱基的破坏、单链的断裂、双链的断裂、分子间的交联、碱基脱落或核糖的破坏等。(三)化学因素
二、dna损伤的类型
根据dna分子的改变，可把突变分为下面几种主要类型。点突变
点突变(point mutation)是dna分子上一个碱基的变异，可分为：①转换(transition)同型碱基，如一种嘌呤代替另一种嘌呤或一种嘧啶代替另一嘧啶。②颠换(transversation)异型碱基，即嘌呤变嘧啶，或嘧啶变嘌呤。点突变可根据发生在dna分子的部位，如发生在启动子或剪接信号部位可以影响整个基因的功能；若发生在编码序列，有的可以改变蛋白质的功能如引起镰状红细胞贫血；有的则为中性变化，即编码氨基酸虽变化，但功能不受影响；有的甚至是静止突变，碱基虽变但编码氨基酸种类不变。缺失
缺失(deletion)是一个碱基或一段核苷酸链乃至整个基因，从dna大分子上丢失。如有些地中海贫血、生长激素基因缺失，再如上述lesch-nyhan综合征是hgprt基因缺失。（三）插入
插入(insertion)是一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸序列插入到dna大分子中去，或有些芳香族分子如吖啶(acridine)嵌入dna双螺旋碱基对中，可以引起移码突变(frame-shift-mutation)，影响三联体密码的阅读方式。（四）倒位
dna链内部重组，使其一段方向颠倒。三、修复机制
光修复机制
这种机制主要存在于低等生物。1.不需要光复活酶
光复活酶(photoreactivating enzyme)也称为dna光修复酶(photolyase)。当280nm紫外线照射dna产生的嘧啶二聚体，在短波239nm照射下，二聚体即分解成单体。2.需要光复活酶紫外线照射使光复活酶激活，能解聚嘧啶二聚体。切除修复
因不需要光照射，故也称暗修复。dna引起大的损伤,包括uv引起的嘧啶二聚体、嘧啶/环丁烷二聚体、几个其它类型的碱基加合物、通过曝露于香烟的烟尘在dna中形成的苯并芘尿嘧啶。一般由切除修复(exc**ion repair)系统修复。该修复途径对所有生物的生存是关键的。在大肠杆菌e.coli中，有一种uv特异的切割酶(excinuclease或uvrabc enzyme)，能识别uv照过产生的二聚体部位。并在远离损伤部位5′端8个核苷酸处及3′端4个核苷酸处各作一切口。像外科手术“扩创”一样，将含损伤的一段dna切掉。dna聚合酶ⅰ进入此缝隙，从3′-oh开始，按碱基配对原则以另一条完好链为模板进行修复。最后由dna连接酶将新合成的dn**段与原来dna链连接而封口(图12-19)。真核细胞的切割核酸酶的作用和机制，是与细菌的酶完全类似的方式对嘧啶二聚体切割。切除修复是人体细胞的重要修复形式，有些遗传性疾病如着色性干皮病(xeroderma pigmentosum)，是常染色体隐性遗传性疾病。纯合子患者的皮肤对阳光或紫外线极度敏感，皮肤变干、真皮萎缩、角化、眼睑结疤、角膜溃疡，易患皮肤癌。此病是由于缺乏uv特异内切核酸酶造成的。(三)碱基切除修复
每个细胞都有一类dna糖苷酶(dna glycosylase)，每一种酶能识别一种dna分子中改变的碱基，能水解该改变的碱基与脱氧核糖间的糖苷键，使改变的碱基脱落，在dna上产生一个缺嘌呤或缺嘧啶的位（apurinic-or apyrimidinic-site，ap site）,再藉切除修复机制进行修复。现知至少有20种不同的dna糖苷酶，各具特异性。如识别胞嘧啶脱氨生成的尿嘧啶，腺嘌呤脱氨基产物，开环的碱基，不同烷基化类型的碱基等。如胞嘧啶脱氨后即成尿嘧啶，若不纠正，可引起类型转换，即g-c→a-t。碱基切除修复（base-exc**ion repair）步骤如下：
1)dna糖苷酶识别损伤的碱基,在碱基和脱氧核糖之间切割。2）ap核酸内切酶切ap位置附近的磷酸二酯键。3）dna聚合酶ⅰ用它的5′3′外切酶活性除去损伤链,从缺口的3′-oh起始
修复合成,用新合成的dna替代。4）最后缺口由dna连接酶封口(图12-20)。尿嘧啶dna糖苷酶修复的发现，解答了一个长年以来的疑题，即组成rna是u，而组成dna却是甲基化为t，即从ump→dtmp，要消耗能量。但u和t都与a互补配对，所编的密码是相同的。生物体为什么花如此代价?现在问题清楚了，尿嘧啶-dna糖苷酶只能切除dna链上的尿嘧啶，而不能切除dna链上的胸腺嘧啶，因为后者c5有一甲基，好像是给尿嘧啶加上一个标签。胞嘧啶脱氨基后形成的尿嘧啶即无此标签，即被该糖苷酶识别为改变了的碱基。若dna与rna一样也用尿嘧啶，那么胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶，与正常部位的尿嘧啶便无法区别，不能纠正，造成子代dna的突变即gc→at。可见dna由t代替u，能增加遗传信息的稳定性。相反，rna不需修复，拷贝数很多，半衰期短，即使有个拷贝的胞嘧啶脱氨基转变为u，影响也不大，合成出来的绝大多数蛋白质还是具有正常生理功能，而且u作为合成原料经济得多。第五节重组dna技术
dna重组(recombination of dna)是自然界常见现象，指的是在两个dna分子之间，或一个dna分子的两个不同部位之间通过链断裂和片段的交换重接，改变了基因的组合序列。这种交换可发生于同一细胞内或细胞间，甚至不同物种的dna。dna重组现象广泛存在于真核细胞、原核细胞乃至病毒和质粒。本节所要介绍的重组dna技术或基因工程(genetic engineering)，是70年代由stanford大学boyer、cohen和berg等科学家建立的一种**性的技术方法，它是在实验室内用人工方法将不同来源，包括不同种属生物的dn**段，拼接成一个重组dna(recombinant dna)分子，将其引入活细胞内，使其大量复制或表达。这种技术方法称为重组dna技术。由于它可以把一个生物体中携带的某一特定的遗传信息(基因)，通过一定的方法转移到另一生物体中，使之获得前者的遗传特征，创造新的遗传组合，所以又称为基因工程，若从遗传角度来考虑也可称为遗传工程。重组dna技术中所含有的目的dna分子或基因需进行无性繁殖、扩增成为一个**(clone)，因此基因工程在不同的场合又可有不同的名称，如分子**(molecular cloning)、dna**、基因**等。4．聚合酶链反应(pcr)扩增dn**段或cdna
以已有dna为模板，通过pcr扩增出所需片段。另可以mrna为模板，采用逆转录酶pcr进行扩增，得到所需要的cdna。(详见下节)。(二)载体
欲将外源基因或dn**段导入宿主细胞进行扩增或表达，需要通过一个能在宿主细胞中进行自我复制并表达目的基因的载体(vector)的介导，目的dna与载体在体外构成重组dna分子，然后导入宿主细胞，进行扩增及表达。以大肠杆菌作为宿主细胞的载体有：质粒、λ噬菌体、粘粒和m13噬菌体等。这些载体分为**用和表达用不同种类，有些还含有在真核细胞中生活及基因表达必须的成分，供不同实验目的选用，多数已作为商品供应。1.**载体(vector of clone)
(1)质粒质粒(plasmid)是细菌染色体外小的双链闭环的dna分子，能自主复制，并含有抗药性基因。较理想的质粒应符合下列条件：
1)要有多个单切口的限制性内切酶的位点，而且外源dn**段插入后，不影响质粒的复制。2)含有抗药性或其他可供筛选的标志，外源dna插入后，抗药性消失，或其他酶活性丧失。3)含有高效的自主复制序列，这样在宿主细胞中质粒复制的拷贝数多。若含有能在真核细胞生活的序列，这种载体则能在真核细胞中生活及表达。pbr322是一种最常用、最基础的质粒。通过人工构建而成，其结构如图12-22所示。大小：4363bp抗药性基因：有两个。氨苄青霉素抗性(ampicillin res**tance,ampr)基因编码β-内酰胺酶(β-1actamase)，能切开氨苄青霉素的内酰胺环，从而使之失效。若在此基因中插入外源dn**段，即破坏该酶的结构。另一四环素抗性(tetracycline res**tance,ampr)基因，编码一种蛋白质，能改变细菌膜的状态，阻止四环素进入细胞而赋予宿主抗四环素的能力。若
该基因被外源dna插入即失活。自主复制(ori)成分(序列),使pbr322在大肠杆菌内能高效进行复制，产生多拷贝。另一些质粒如puc系统，除含ampr基因外，还含大肠杆菌的lacz基因也常被用作为...