手**物前体的国内外研究进展
手性有机酸的研究、生产和发展趋势
孙志浩
（江南大学，生物工程学院生物制药研究室，无锡，214036）
1 前言
手**物是当前国内外新药研究的热点，手性、手性技术成了新药研制中的重要关键词。特别是2001年度的诺贝尔化学奖给了研究手性化学的3位得主。国内也报道：中科院上海有机所等单位承担的**自然科学基金“九五”重大项目“手**物的化学与生物学研究”通过了验收，项目总评为特优，达到了国际先进水平，代表了我国在手**物的化学与生物学研究的最高水平。最近，**自然科学基金委重大项目“手性与手**物研究中的若干科学问题研究”，拟资助经费800万元。说明手性与手**物研究是一个前沿研究领域，研究手性关键技术是发展手**物的切入点。有专家认为，国外在手**物的开发与研究方面已取得了可喜成绩，但我国目前还没有一个真正属于自己创新的手**物进入临床和生产阶段。因此建议必须结合国情，力求有所突破。认为首先要提高手性制备技术，研究实用的手性合成方法，特别是发展生物催化制备技术。建议将研究及开发手性催化剂、手性骨架、手性中间体等作为重点，研究及开发理想的光学结晶剂、不对称化学触媒、手性辅料、手性溶剂、手性酸、手性碱等，使之能以较低的生产成本，大量生产商品化手**物。大约在80年代。科学家提出一种新思路，即对含有数十万乃至数十亿个化合物的化学库进行同步合成和筛选，这一方法称为组合化学。短短十多年时间，组合化学就已经显示了它旺盛的活力，成为化学、药物和材料科学研究中的一个热点。最近提出组合生物催化，将生物催化和组合化学结合起来，即从某一先导化合物出发，用酶催化或微生物转化的方法产生化合物库。这是药物研究领域中继组合化学之后的又一新技术。目的之一是增加库中化合物的多样性，提高库的质量。有机酸—是手性合成的基本材料之一。作为手**物的重要手性合成子，手性砌块，手性试剂，拆分剂，在组合化学化合物库中具有举足轻重的地位。本文介绍几种有代表性的手性有机酸的研究、生产和发展趋势。由于作者知识面的局限，这里提到的仅限于与生物催化有关的几种有机酸。2 α-羟基酸
主要有α-羟基丙酸（乳酸）、α-羟基丁二酸（苹果酸）、αβ-**丁二酸（酒石酸）、α-羟基**（扁桃酸）等及其衍生物。α-羟基酸在手性合成中主要是作为拆分试剂，也是重要的手性合成单元。例如l或d-酒石酸，比较小的分子中有两个不对称碳原子，但也是对称性结构良好的化合物，光学活性的酒石酸或其衍生物在手性合成中应用非常广泛。2.1 乳酸
乳酸是最简单的手性化合物。是一种重要的手性合成单元。l-乳酸是众所周知的产品，用发酵法生产，已有很大规模。这里介绍d-乳酸。d-乳酸及其酯，主要作为医药、农药合成原料，如ca拮抗剂降压药甲基吡啶衍生物、除草剂以及手性试剂s-2-氯丙酸等的原料。1984年日本开发了高e.e.d-乳酸发酵法制造技术。タィセル日本化学工业公司1997年产d-乳酸近10吨，供医药、农药原料。basf公司用d-乳酸异丙酯生产s-2-氯丙酸（e.e.98%），作除草剂duplosanr的手性合成原料，1997年大规模投放市场。d-乳酸可用发酵法制造，不少菌种能发酵葡萄糖产生d-乳酸。欧洲已有大量生产。由于发酵和提取的复杂性，规模太小成本高。d-乳酸（或d-乳**）也可以用酶法制备，用酯酶水解拆分，将dl-乳酸**中的l-乳酸**进行酶水解，生成l-乳酸和乙醇，未能水解的d-乳酸**，可用蒸馏等方法分出。lipase
dl-乳酸**—→l-乳酸＋乙醇＋d-乳酸**
酶法优点是酶水解反应较简单。关键是需要筛选最适合的酶或产酶微生物，如果筛选出的脂肪（酯）酶较贵，还需要研究固定化技术，或者自行筛选产该酶的菌种自行发酵产酶，研究工作量大。**化学工业研究所近期报道了用sigma公司购买的脂肪酶水解乳酸**，将l-乳酸**水解，分出d-乳酸**产品（e.e.95%），用于降血脂药及含d-乳酸光学活性结构药物之合成。我们从收集的十多种脂肪酶进行酶水解研究发现，酶水解乳酸**的选择专一性不强，几乎是对两种构型的乳酸**都能水解。我们筛选到一种水解l-乳酸**相对比较强的脂肪酶，并利用其不同的水解动力学特性，制备了高光学纯度的d-乳酸**（e.e.＞97%）。还可以用酶或微生物选择性分解或消耗dl-乳酸中的l-乳酸的方法，制备d-乳酸：
[o]或-h2
dl-乳酸—→**酸＋h2o2＋d-乳酸
（或微生物）└—→co2＋h2o
用l-乳酸脱氢酶或氧化酶可将dl-乳酸中的l-乳酸选择性转化或分解，得到不被酶反应的d-乳酸。此种酶法优点是产品光学纯度高，有一些研究文献与专利报道。但脱氢酶或氧化酶昂贵，酶反应过程中需要辅酶nad（h）等，存在辅酶再生问题，实用性小。用微生物选择性利用dl-乳酸中的l-乳酸，直接将dl-乳酸中的l-乳酸作为营养选择性地消耗掉，能得到不被微生物利用的d-乳酸。作者的实验室已进行了一些初筛工作，未发现有专一性特别好的、仅消耗单一l-乳酸的微生物。但发现有些微生物消耗l-乳酸速度比消耗d-乳酸速度快，如芽孢杆菌属（bacillus），假单孢菌属（pseudomonas），埃希杆菌属（esherichia）等的一些菌具此特性。将消旋dl-乳酸混合物与该微生物共培养，或者与培养后的微生物相接触，dl-乳酸中的l-乳酸优先被选择性消耗，可得到尚未被微生物利用的d-乳酸。我们筛选到2株具不对称水解特性的微生物，也收集到文献介绍的菌株枯草杆菌（bacillus subtil**），枯草杆菌培养基中消旋乳酸5 g/l，残存d-乳酸2.2.1苹果酸
l-苹果酸是近年开发的重要有机酸产品之一。它是新型的食品、饮料酸味剂，也是重要的医药原料。日本首先研制成功酶转化方法。我国前几年也搞得很热，最多时全国有三十多家，现在多数停产、转产，仅一家正常生产。酶反应式如下：
延胡索酸酶
反**二酸—→l-苹果酸
延胡索酸酶来自细菌（如黄色短杆菌或产氨短杆菌）、酵母（如褶裂酵母）、霉菌（如文氏曲霉）。卡拉胶固定黄色短杆菌细胞连续酶转化生产l-苹果酸，酶反应器1m3，转化液产品浓度7%以上，一次mol转化率75%以上（未转化的富马酸可回用），酶块使用1年以上，非常稳定，体现了酶工程技术的典型优点。目前l-苹果酸的生产成本已降至1.5万元/吨以下，可以做到与合成dl-苹果酸的成本相当。欧阳平凯课题组用组合合成工艺对l－苹果酸的生物转化过程进行了研究。利用苹果酸钙溶解度极低，转化产物以苹果酸钙结晶沉淀形式可脱离反应体系的特性，采用反应与结晶耦合技术，使反应产物不断形成苹果酸钙，平衡向右侧移动。转化率接近100%，产物浓度提高40倍，反应速度大大提高。而且，在反应与分离耦合中酶活力未见降低。将组合合成技术成功的应用于l－苹果酸的产业化，工艺流程短，操作简单，系统应用成本进一步下降。d-苹果酸一般用dl-苹果酸化学拆分制备。也可以与d-乳酸的生产方法类似，用酯酶水解拆分，将dl-苹果酸**中的l-苹果酸酯进行酶水解，生成l-苹果酸，分出未能水解的d-苹果酸酯。或者用l-苹果酸脱氢酶或氧化酶可将dl-苹果酸中的l-苹果酸选择性转化或分解，得到不被酶反应的d-苹果酸。或者用微生物选择性消耗掉dl-苹果酸中的l-苹果酸，得到不被微生物利用的d-苹果酸。这方面的研究文献不少。但未见发酵方法生产d-苹果酸的报道。2.2 酒石酸
l（+）酒石酸，又称d-酒石酸，也是一种重要的食品、饮料酸味剂。在医药中作为原料生产酒石酸盐药物，还是极重要的拆分剂（如用于甲砜霉素、乙胺丁醇等），过去每年要进口上千吨。d-酒石酸的生产方法主要是从酿造葡萄酒副产物酒石中提取，主要产地在西欧，年产量数万吨，由于受气候、葡萄种植及酿造业的影响而波动，供应价格也不稳定。日本人开发了酶法生产方法，我们也成功地研制了固定化诺卡氏菌细胞生产l-（+）酒石酸，底物顺式环氧琥珀酸，由顺酐或顺**二酸制备。酶反应式如下：
环氧琥珀酸水解酶
顺式环氧琥珀酸—→l（+）酒石酸
目前国内生产规模已超过3000吨（3家），固定化酶柱1m3，mol转化率90%以上，固定化酶半衰期5个月以上。生产成本2万元/吨左右。创造了很好的经济效益，满足了国内需求，还能大量出口，能与从酒石中提取的l-（+）酒石酸竞争，成为世界上第二种生物技术大规模生产l-（+）酒石酸的方法。d-酒石酸一般用dl-酒石酸化学拆分制备。也与d-苹果酸一样，可以用酯酶水解拆分，或者用脱氢酶或氧化酶选择性转化或分解，或者用微生物选择性消耗利用等方法制备。也未见发酵方法生产d-酒石酸的报道。日本东レ化学研究所**研究员佐藤治代（haruyo sato）很好地综述了用微生物选择性消耗利用dl-酒石酸中的l-酒石酸，进行工业生产d-酒石酸的方法（见：中井武，大桥武久，キラルテクノロジ-の工业化，p.119-127.日本，シ-ェムシ-，1998）。该公司用恶臭假单胞菌（pseudomonas putida）生产d-酒石酸，培养液中几乎无其他杂酸，分离精制容易，见下图所示。2.3 扁桃酸
1.4.1?扁桃酸的光学拆分
早期扁桃酸（mandelic acid，ma）是用**、辛可宁等生物碱进行拆分的，拆分剂价高，有毒性，有管理上的问题。现改用光学活性的苯乙胺（phenethylamine，pea）进行拆分，对消旋ma能得到高收率的光学活性体。最近开发了用酶或微生物方法，高效，仅得到所希望异构体的合成方法。α-酮**酯经面包酵母发酵可得到光学纯度为91-100%的r-扁桃酸酯。由苯甲醛与氰酸容易合成氰醇，用仅对r-体选择性水解的微生物，能将消旋体原料全部转变为r-ma，此方法已由日本日东化学公司进行工业化生产。（见：村上尚道，フアィンケミカル特集：キラルテクノロジ－工业化の展望，26(8)，55—62，1997）
这是非常简单的、选择性优良的、可以将消旋体100%转变为r-ma的制法。上述路线现今仅限于制备r-体，尚未发现对s-体高选择性的微生物。但发现红球菌rhodococcus能将扁桃腈水解得到s-扁桃胺，于是日东化学公司采用添加亚硫酸的方法，将产生的s-扁桃胺进一步转化为s-ma。（田村钢二等，见：中井武，大桥武久，キラルテクノロジ-の工业化，p33-44.日本，シ-ェムシ-，1998）
化合物〔10〕(镇咳剂右美沙芬，dextromethorphan，一种无成瘾性中枢镇咳药)的中间体，以往用酒石酸等天然拆分剂拆分，而现在已主要用ma拆分。还有〔11〕及〔12〕，是最近开发的抗抑郁剂，在合成的最终阶段进行拆分。化合物〔4〕是作为抗生素侧链大量使用的d—苯甘氨酸的酰胺。在苯甲醛的存在下，将消旋体与(s)—ma加热，(r)—4和(s)—ma的盐选择性生成。（w.h.j.boesten[dsm],ep 442,584,1991）
3 β-羟基酸
3.1 光学活性β-羟基脂肪酸的合成
光学活性β-羟基酸，是具有不对称碳原子的双功能性物质，作为有机合成的基础材料，广泛用于合成多种生理活性物质。光学活性β-羟基酸的大量生产方法尚未开发。利用微生物的脂肪酸β-氧化酶的立体特异的β-氧化反应，用便宜的脂肪酸为原料，可进行光学活性β-羟基酸的工业生产。文献报道，用微生物的脂肪酸的β-氧化，是经由（s）-β-羟基（~coa）途径进行的，由恶臭假单胞菌pseudomonas putida得到的β-羟基异丁酸（β-hiba）、由毛霉（mucor sp.）得到的c6~c12的β-羟基酸都是（s）体。由于β-羟基酸容易代谢，收率低。（用ps.putida生产（s）-β-hiba，最大积累量为9.3g/l，收率41%，是很低的）。作为手性合成原料，不仅需要（s）-体，许多情况下更需要（r）-体。最初，在筛选产（r）-β-hiba微生物时，用异丁酸作基质。结果为，大部分微生物产（s）体，仅发现皱褶假丝酵母（candida rugosa）等几种微生物产（r）-体。β-氧化途径是生物体中脂肪酸的主要的代谢途径，其酶活性很强，由于中间代谢产物β-羟基酸极其容易代谢，难以积累。分支状的β-羟基酸β-hiba比较难代谢，易积累，而β-羟基丁酸等直链酸则几乎没有积累。因而，为了高收率地生产各种β-羟基酸，必须进行微生物变异改良，以及进行代谢调节研究。用ntg诱变c.rugosa，得到β-hiba分解酶的β-hiba脱水酶缺失株，使（r）-β-hiba的收率大幅提高，另外，也未发现合成中有副产物β-羟基丙酸。关于直链（r）-β-羟基酸的生产，c.rugosa在丁酸为基质的培养时，完全不产生（r）-β-羟基丁酸。同样地，用ntg处理得到不利用丁酸菌株，从中筛选羟基酸生产菌株，以c4—c7脂肪酸为原料，可生产相对应的β-羟基酸。经过菌株筛选、诱变等，得到表1所示的（r）、（s）两对映体β-羟基酸。表1 工业生产可能的β-羟基酸
（r）-β-羟基丁酸甲酯也可由发酵法生产的聚β-羟基丁酸经酸性催化下的甲醇解制备，产物的光学纯度99.5%ee以上。3.2 光学活性β-羟基脂肪酸的应用
光学活性β-...