问无限火力出现“贴膜流”盲僧，无限护盾让敌方丧失游戏体验，胜率高达90%，怎么玩呢？

是rt-pcr啊。一、实验器具与材料：
1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸头：1ml、200μl、20μl
3、匀浆管：5ml
4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个
5、ep管：1.5ml、0.2ml、100μl
6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）
1个125ml的白色试剂瓶（放**）
7、量筒：50ml、250ml、500ml
8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml
9、试管架：5ml、1.5ml、20μl
10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装**，另一个装depc水
11、铝制饭盒：4个
12、塑料小饭盒：1个
13、大瓷缸：2个
14、锡泊纸：一卷
15、卷纸：2卷
16、三角烧瓶：带盖，稍大
二、实验器具的处理与准备
1、塑料制品：（包括枪头、ep管、匀浆管等）
先将depc水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入depc水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（ep管）
2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（depc水泡）（洗净后先泡1‰depc过夜，再烤干）
3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡depc）
三、试剂配制：
1、depc水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰depc水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。2、75%乙醇：用** depc水配，然后放-20℃保存（其中depc水需先高压）
3、异丙醇：放入棕色瓶中
4、氯仿：放入棕色瓶中
5、琼脂糖
四、几种缓冲液的配制：
1、电泳缓冲液：
tr** 54g
** 27.5g
0.5m edta 20ml？ph8.0
蒸溜水 1000ml
5×tbe（贮存液）
再将5×tbe稀释10倍成0.5tbe就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液 450ml水-→500ml工作缓冲液
2、上样缓冲液：
0.25%溴酚蓝
0.25%**青ff
30%**
6×缓冲液，4℃保存
五、琼脂糖凝胶的配制：
1、1.0%：
1.0g琼脂糖 100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。2、1.5%:
同上，将琼脂糖的量改为1.5g
六、需购置的rt-pcr材料：
（生工.tel.2236106.）
taq酶（含mgcl2 buffer）200u 70.00
dntp:1支
oligo(dt)15:1 od 40.00 promega
m-mlv:1支 250.00 promega(buffer)
rnasin:1支 110
20℃
depc 5g 110.00
trizol 100ml/1瓶 invitrogen life technologies
4℃
marker:10μg 0.2μg/ml 150.00 科威
（1543.994.697.515.377.231）
七、引物合成
正义：5′-cacgatggaggggccggactcatc-3′
反义：5′-taaagacctctatgccaacacagt-3′
2、par-4:
正义：5′-gggacctcggaactcaac-3′
反义：5′-tgtatctgcctgggactg-3′
3、退火温度计算
2（a t）4（g c）
正反义平均数，再上下波动度（±4℃，或±5℃）
4、引物各合成5 od，每od一瓶分装好
5、引物稀释：
加depc水量为（μl）
nmol/od×管上所标od数×100
是为10p mol/μl 浓度的引物溶液
八、pcr产物电泳
先将1-10μl左右pcr产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10ma，电源100v，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。九、几个注意点：
1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？2、rt时，先打开pcr预热30分钟。3、rna**前，打开离心机预冷。trizol法**总rna
细胞1×107
组织100mg
加1mltrizol
细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块
匀浆（要彻底，后转至ep管）
（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每ep管）
颠倒混匀10下，室温5分钟
加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）
颠倒混匀10下，室温5分钟
4℃，离心12000g，15分钟
转上层水相（约400μl）于另一1.5mlep管中
加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟
4℃，离心12000g，10分钟
弃上清
加冰预冷的75%乙醇（用depc水配）1ml
4℃离心7500g，5分钟
弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥）
溶于depc水中至20μl（10μl-20μl）
（可在55-60℃水中，分钟助溶）
注：
1、rna若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则depc溶解
2、细胞组织加trizol匀浆后，可在-60℃放置至少一个月（甚至可一年以上）
3、rna在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年
两步法rt-pcr
（第一步：逆转录反应）
试剂 浓度 体积 终浓度
rna 23μl(11.5μl)
oligo(dt)15 0.05μg/μl 4μl(2μl)0.005μg/μl
（稀释10倍后用）
混匀，离心，70℃ 5min
立即冰水浴，稍离心
试剂 浓度 体积 终浓度
m-mlv buffer 5×8μl(4μl)1×
dntp 10mm 2μl(1μl)0.5mm
rnasin 40u/μl 1μl(0.5μl)20μ
m-mlv 200u/μl 2μl(1μl)200u
总体积40μl（20μl）
混匀，离心，42℃ 60min
95℃ 10min（破坏mlv）
4℃保存
两步法rt-pcr
（第二步：pcr反应）
总体积20μl(50μl)
试剂 浓度 体积 终浓度
taq buffer 10×2μl(5μl_)1×
mgcl2 25mm 1.2μl(3μl)1.5mm
dntp 10mm 0.2μl(0.5μl)
上游引物 10pmol/μl 0.3μl(1μl)10pmol
下游引物 10pmol/μl 0.3μl(1μl)10pmol
cdna模板 x?(1-10μl)
depc水 20μl-4.3μl-x
taq酶 2.5u/μl 0.3μl(1μl)2.5u/μl
混匀
97℃，5分钟
立即冰水浴
混匀
95℃ 5分 预变性
94℃ 30秒 变性
x℃ 40秒 退火
72℃ 30秒 延伸
72℃ 7分 终末延伸
28-36循环，4℃保温
三、电泳：
加1-10μl pcr产物 溴芬兰（1-2.5μl）混匀，加样，电泳。注意：taq酶、m-mlv、rnasin等-20℃保存，操作时置于冰上。dntp勿反复冻融。